儀器極限，HPLC，LC/MS/MS

最近一兩個月，因為三聚氰胺污染奶粉的問題，使得几個藥物分析的專業術語常見於媒体，筆者試圖在此簡略地對它們稍作解釋，以幫助大家進一步了解。

首先，儀器極限，是什麼意思，是怎麼界定的。嚴格地說，這個名詞在專業術語上，應該是指，儀器能偵測到的最低可定量濃度(lowest limit of quantitation,LLOQ)。在藥物生体痕量(trace)分析中， 美國FDA的作業規範，要求這個最低可定量濃度的檢品，在儀器上產生的藥物訊號強度，一定要比空白檢品的雜質訊號強度，大5倍以上，這樣”高”的濃度才是儀器極限，不是隨便只看到有一點藥物訊號出現，就可含含糊糊地認定那是儀器極限。一定要大於5倍才可以，而且一定要跟，同質材(同是奶粉)配製出的空白檢品比較才可以，不能與純溶液的空白液比較。界定的時侯，通常會用同質材配製一系列標準品，含藥濃度逐步降低，同時也配製一個不含藥物的空白對照檢品，把這些檢品處理淨化後，一一送進儀器分析，一一得到藥物訊號，然後一一與空白檢品的雜質訊號比較，那一個濃度的藥物訊號強度，剛好大於空白檢品訊號的5倍，那個濃度就是儀器的極限。HPLC 也好,LC/MS也好,LC/MS/MS 也好，都要遵循這個準則。

通常，在分析檢品時，一定要同時分析這個最低可定量的LLOQ標準品，以及同質材(同是奶粉)配製出的空白檢品，先確定LLOQ標準品的訊號，的確大於空白檢品訊號5倍，確定了儀器的效能，再分析檢品、檢量標準品及品管檢品。任何檢品分析得到的藥物訊號強度，若大於這個LLOQ標準品的訊號強度，就可以報告所得到濃度數字，ppm,或ppb，也就是所謂的”檢出”，若小於這個LLOQ標準品的訊號強度，只能報告為低於LLOQ，，低於最低檢測濃度XX ppm，也就是所謂的”未檢出”，不能報告為”沒有或是不含有或是0 ppm或0 ppb”。

一套HPLC儀器包括幫浦、進樣器、柱管、偵測器，以及訊號處理器。柱管是核心，它是用來分離藥品與各種雜質。柱管內充填著很細(5um)的特種細粉，用一個高壓幫浦把一個特製的混合溶液打入柱管。檢品經過處理淨化後，送進柱管內進行分離。由於粉末很細，表面積很大，藥物一路向末端流出的過程中，與特種細粉接觸交互作用机會很多時間也很長，而藥物的化學性質與雜質必有不同，經過這麼多的交互作用後，藥物就會與雜質分開。這种細小粉末的分離效果很高，因而得名為高效(high performance,HP)，又因為分離過程是在液体中進行，因而名之為液相(liquid,L)，以別於氣相(gas)，又因為分離完後，各化合物在柱管中形成層層帶狀，因而稱為層析(chromatography,C)，全名縮寫簡稱就叫HPLC，高效液相層析儀。

如果幫浦送出液体的速率恒定不變，藥物流出柱管的時間也就固定不變，檢品中的藥物，流出的時間與標準品之時間應該相同。HPLC利用這個性質來確認藥品，稍嫌不夠周密嚴謹。

溶液流出柱管後，進入紫外線偵測器，三聚氰胺是在240nm紫外線下偵測它的吸收，它產生訊號的強度還算很強，但是分辨雜質的效果就不是很好。奶粉中存有很多雜質，它們在240nm也會有吸收，也會產生訊號。如果在柱管中，雜質沒有完全分開，而出現在三聚氰胺流出的時間位置，那個雜質會讓人誤以為是三聚氰胺，導致對無摻放的檢品誤判為檢出，或是對有摻放的檢品高估其含量。另外，既使分離得很好，奶粉的空白檢品難免還會呈現一些小雜質，訊號雖不大，但會明顯增大最低可定量的濃度，因為LLOQ要大於這個小雜質的5倍。

這些先天的限制，再加上，三聚氰胺吸收紫外線，產生訊號的強度，受到本身的限制，HPLC 偵測三聚氰胺的極限也就只在1-10 ppm 之間。有些情況，這個靈敏度也夠用的，足以檢測污染的奶粉。這個技術己經廣用了二十几年，儀器普遍，人人熟悉，操作容易，上手很快，臨時有大量檢品要快速檢驗時，很容易可動員散佈在各處實驗室的儀器及人員，用同一方法來檢驗。畢竟它還是一個經典的現代藥物分析儀器。

經過柱管分離的溶液，也可以聯結到質譜儀上。每一個藥物都有分子量，在這裡，三聚氰胺是126，它進入質譜儀後，先氣化再變成帶電離子(127amu)，飛入質譜儀，進入它的核心，質量分辨器。此時，可以調節、設定儀器條件，只讓127amu離子可以直飛通過分辨器，其餘的離子偏離飛行方向，碰壁不能通過。通過的離子，被捕捉後大量放大而產生訊號。這種把LC的流出液，只聯結(經過)到一個質量分辨器的儀器叫LC/MS，MS 是mass spectrometer，質譜儀的縮寫。

奶粉中的雜質很多，其中難免也有一些，也會產生127amu離子，同樣地，通過質量分辨器，而出現雜質干擾訊號，雖然如此，但比紫外線好很多了，127就是127，是一條線，126或128離子就不會通過，特異專一性很高，不像紫外線的240nm，其實是一個寬帶(240+-3nm)，含蓋範圍大，雜質容易出現。雜質恰好是127amu，而且流出時間位置又與三聚氰胺相同的，就更少了，只聯結一個質譜儀，LC/MS，己經是一個很特異又敏感的儀器。

通過第一個質量分辨器的三聚氰胺127amu離子，可以繼續讓它飛進一個踫撞室，用氮氣去撞破這個離子，撞成几個碎片，在這裡，三聚氰胺的127amu離子被撞破成85及68amu的碎片，再飛入串聯的第二個質量分辨器，同樣地，此時，可以調節、設定儀器條件，只讓85及68amu離子可以直飛通過分辨器，其餘的離子偏離飛行方向，碰壁不能通過，通過的離子，被捕捉後大量放大而產生訊號。這種經過二個串聯質量分辨器的方法叫LC/MS/MS.全名就叫高效液相層析串聯質譜儀。

再經過這樣一次分辨以後，得到的訊號就几乎全是三聚氰胺的了，因為通過第一個分辨器的127amu離子雜質，它們的碎片，恰巧也是86及68的可能性就太少了。因此，LC/MS/MS ，基本上，解決了雜質的問題，雜質帶來的訊號太高，使LLOQ的濃度相隨上增的障礙，在這裡几乎沒有了。在三聚氰胺流出的時間位置上，几乎沒有雜質訊號，只有儀器本身的雜訊，而質譜儀儀器本身的雜訊也比HPLC的紫外線偵測器低很多。另一方面，三聚氰胺變成離子及碎片，最終產生訊號的產量也很高，這三個有利因素加起來，LC/MS/MS對三聚氰胺的偵測能力就變得非常靈敏，濃度很低的檢品，藥物訊號都很容易可以高於儀器雜訊的5倍，最低可定量的濃度一下子就降到ppb級。

撞破了的碎片，主要是什麼離子，例如三聚氰胺主要是86amu及68amu，是一個一個不同化合物的特性，另一方面，各離子的相對強度也是一個一個不同化合物的特性，對三聚氰胺而言，86及68離子的相對強度，它們的比值是它的一個特性。結合這二种特性， LC/MS/MS，除痕量ppb級定量外，同時具有很準確的藥物確認功能。在三聚氰胺同一時間位置流出的化合物，如果這二個離子強度的比值與標準品的比值相符則定是三聚氰胺，不符則是雜質。如此，一個分析結果，同時能定痕量，又能準確的確認藥物，一役畢其功，實在很理想。

只是這种偵測器，其內的質量分辨器非常精密，非常貴，二個串聯起來更貴，又需要專利的特殊裝置來產生離子，平時運行時，需要高度真空，需要高純度氮氣，需要超高效能電腦處理訊號。因此整部儀器，比紫外線偵測器，貴很多很多倍，還需要很專門的人才來負責，因此，除特殊需要以外，國內的大學以及公家單位，目前還未普遍用來作例行的檢品分析，大部分都用在作學術研究。

奶粉中的三聚氰胺可以這麼偵測, 其中可能也污染存在的三聚氰酸(cyanuric acid )，同理，也可以這麼偵測，而且可以同時測定。最近己有報告証實，動物若一起餵食這二個化合物，很容易會引起腎結石，所以，從毒理學上來講，真正較有意義的檢驗，應該是用LC/MS/MS同時偵測三聚氰胺以及三聚氰酸。(用HPLC同時偵測此二物，困難加倍，費時費力，測定濃度不夠低，在毒理學上，效果也不佳)。但願我們的衛生單位，己經分出一部分力量，開始這麼做了。